Proiect: „Studii microbiologice și biotehnologice privind proteinele stratului s produse de Lb. helveticus 34.9 cu aplicații moderne” (PN-III-P1-1.1-PD-2019-0808)
Programul 1 - Dezvoltarea sistemului național de cercetare-dezvoltare
Subprogramul 1.1 - Resurse umane
Proiecte de cercetare postdoctorală
Contract de finanțare PD nr 44/2020
Acronim: MIBIS
Director de proiect: Dr. Roxana Angelescu
DETALII PROIECT
Proiect: „Studii microbiologice și biotehnologice privind proteinele stratului s produse de Lb. helveticus 34.9 cu aplicații moderne” (PN-III-P1-1.1-PD-2019-0808)
Programul 1 - Dezvoltarea sistemului național de cercetare-dezvoltare
Subprogramul 1.1 - Resurse umane
Proiecte de cercetare postdoctorală
Contract de finanțare PD nr 44/2020
Acronim: MIBIS
Microbiological and biotechnological studies on S-layer proteins produced by Lb. helveticus 34.9 for modern applications
Studii microbiologice si biotehnologice privind proteinele stratului S produse de Lb. helveticus 34.9 cu aplicatii moderne
Director de proiect: Dr. Roxana Angelescu
Durata contractului: 24 luni
Valoarea totală a contractului: 246 950 lei
Din care, pe surse:
Sursa 1 – de la bugetul de stat: 246 950 lei
Sursa 2 – din alte surse atrase: 0 lei
Autoritatea Contractantă: Unitatea Executivă pentru Finanţarea Învăţământului Superior, a Cercetării, Dezvoltării şi Inovării
Contractor: Institutul de Biologie Bucuresti
REZUMAT PROIECT
[EN] Lactobacilli represent an important group of lactic acid bacteria frequently used in food industry due to their biotechnological potential and positive effect on human health, being used as probiotics or starter cultures for fermented foods. Bacteria engineered for increased performances will always represent a focus point for researchers in the food, medical, pharmaceutical and biotechnological industries which are conducting constant research for new, safe, cost effective, and easy methods and techniques for human life improvement. In this respect, lactobacilli have been shown to produce surface-layer (S-layer) proteins with great bio- and nano-technological potential application. S-layer represents the outmost structure of the cell envelope having important physiological role for the producing cell and for the bacteria-host interactions. Understanding the structure and properties of S-layer is a critical step for developing technological and health applications. The present proposal aims to study the biosynthesis, biological role, and functional importance of S-layer proteins produced by Lactobacillus helveticus 34.9 (a bacteriocin and S-layer producing strain), using a multidisciplinar approach, combining both classical and modern investigation methods. The findings will help to better understand the role and importance of the S-layer for the producing cells and for the relation between bacteria and colonized host, respectively. The project may ultimately deliver an important instrument for future biotechnological applications.
[RO] Lactobacilii reprezinta un grup important de bacterii lactice utilizate frecvent in industria alimentara datorita potentialului lor biotehnologic si efectelor benefice pe care le au asupra sanatatii omului, fiind folosite ca probiotice sau culturi starter pentru obtinerea de alimente fermentate. Bacteriile modificate in sensul imbunatatirii performantelor lor, vor atrage mereu atentia cercetatorilor din domeniul alimentar, medical, farmaceutic sau biotehnologic, care desfasoara in mod constant cercetari in vederea elaborarii unor metode si tehnici noi, sigure, rentabile si facile pentru imbunatatirea vietii umane. In acest sens, s-a demonstrat ca lactobacilii produc proteine de suprafata (strat S) cu un important potential aplicativ bio- si nano-tehnologic. Stratul S reprezinta invelisul proteic extern al celulei bacteriene, cu rol fiziologic major pentru celula producatoare si pentru interactiunile dintre aceasta si gazda pe care o colonizeaza. Intelegerea structurii si proprietatilor stratului S este o etapa fundamentala pentru dezvoltarea unor practici in domeniul tehnologic sau cel al sanatatii. Prezenta propunere de proiect are ca scop studierea biosintezei, rolului biologic si importantei aplicative ale proteinelor stratului S produse de Lb. helveticus 34.9 (o tulpina care sintetizeaza atat bacteriocine, cat si strat S), folosind o abordare multidisciplinara, combinand atat metode de analiza clasice, cat si moderne. Rezultatele obtinute vor ajuta la intelegerea aprofundata a rolului si importantei stratului S pentru celula producatoare, dar si pentru relatia cu gazda colonizata. În cele din urmă, proiectul poate furniza un instrument important pentru viitoare aplicații biotehnologice.
OBIECTIVE
- Etapa 1 - Caracterizarea parțială a proteinelor stratului S.
- Act 1.1 - Cultivare Lb. helveticus 34.9 si extragere strat S.
- Act 1.2 - Purificare strat S și caracterizarea parțială a acestuia.
- Etapa 2 - Caracterizarea biochimică și biologică a stratului S.
- Act 2.1 - Caracterizarea stratului S prin metode moderne.
- Act 2.2 - Investigarea rolului antimicrobian al stratului S.
- Act 2.3 - Investigarea reformării stratului S după extragerea acestuia de la suprafața celulară
- Act 2.4 - Analiza rolului biologic al stratului S pentru protecția celulară.
- Act 2.5 - Pregătirea celulelor de Lb. helveticus 34.9 pentru observații microscopice.
- Etapa 3 - Evaluarea potențialului biotehnologic al celulelor producătoare de strat S.
- Act 3.1 - Observații microscopice ale celulelor de Lb. helveticus 34.9, producătoare de strat S.
- Act 3.2 - Cultivarea celulelor umane.
- Act 3.3 - Investigarea adeziunii Lb. helveticus 34.9 la celule umane.
[EN] RESULTS
[RO] REZULTATE PROIECT
[EN] STAGE 1. (2020)
[EN] The first part of the project aimed to cultivate the S-layer-producing strain selected for this study, Lb. helveticus 34.9, extraction and partial characterization of this protein. The bacterial strain was cultured in MRS medium, under optimal conditions (37 ° C), and the surface proteins (S layer) were extracted with two different concentrations of LiCl. Following SDS-PAGE electrophoresis and quantitative determinations, the best extraction method was found to be 2.5 M LiCl (620 mg / ml) compared to 5M LiCl (380 mg / ml). The obtained S layer was partially purified and characterized. SDS-PAGE electrophoresis showed a protein molecular weight of approximately 40-55 KDa.
The amplification of the gene corresponding to the S-layer synthesis provided an amplicon with molecular weight specific to the primers for the slpA gene, and the sequence of the obtained amplicon showed an identity of 99.78% with the S-layer gene from other 5 Lb. helveticus strains.
Using the ExPASy program, the nucleotide sequence was "translated" into constituent amino acids. All the objectives proposed for this first stage of project implementation have been accomplished.
[RO] ETAPA I. (2020)
[RO] Prima parte a proiectului și-a propus cultivarea tulpinii producătoare de strat S selectată pentru acest studiu, Lb. helveticus 34.9, extracția și caracterizarea parțială a acestei proteine. Tulpina bacteriană a fost cultivată în mediu MRS, în condiții optime (37°C), iar proteinele de suprafață (stratul S) au fost extrase cu două concentrații diferite de LiCl. În urma electroforezei SDS-PAGE și a determinărilor cantitative, s-a observat că cea mai bună metodă de extracție a fost cu LiCl 2,5 M (620 mg/ml), comparativ cu LiCl 5M (380 mg/ml). Stratul S obținut a fost purificat și caracterizat parțial. Electroforeza de tip SDS-PAGE a arătat o greutate moleculară a proteinei de aproximativ 40-55 KDa.
Amplificarea genei corespunzătoare sintezei de strat S a furnizat un amplicon cu greutate moleculară specifică primerilor pentru gena slpA, iar secvența ampliconului obținut a arătat o identitate de 99.78% cu gena pentru strat S de la alte 5 tulpini de Lb. helveticus.
Folosind programul ExPASy secvența nucleotidelor a fost ,,tradusă” în aminoacizi constituenți. Toate obiectivele propuse pentru această primă etapă de implementare a proiectului au fost îndeplinite.
[EN] STAGE II. BIOCHEMICAL AND BIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF THE S-LAYER
[EN] The second part of the project aimed the biochemical and biological characterization of the S-layer synthesized by Lb. helveticus 34.9. During this stage, the S-layer was characterized by modern methods, namely: two-dimensional electrophoresis, LC-MS and N-terminal end sequencing. These analyzes showed that the S layer has an isoelectric pH of about 6.9, a molecular mass of about 48 kDa, and an N-terminus consisting in arginine and threonine.
The experiments performed during this stage showed that the surface proteins did not have antibacterial activity against the Gram-positive or negative pathogenic strains used in this study, but the inhibition of Lb delbrueckii subsp. bulgaricus LMG 6901T strain growth was observed. In addition, co-aggregation of Lb. helveticus 34.9 cells was observed with most bacteria tested, pathogenic or non-pathogenic.
The cells whose S-layer was removed have the ability to resynthesize their outer protein coat, this reformation taking place in the first hours after resuspension in the optimal culture medium. In addition, the growth curve suggests that 5M LiCl-treated cells tend to prioritize cell outer structure reformation, with the cell division process beginning after cell integrity is restored.
From the analysis of the electrophoretic profile of the S-layer proteins it was observed that they are present throughout the cell growth, but they are more abundant in the exponential growth phase indicating the protective role of the S-layer during cell division. Removal of this coating by treatment with 5M LiCl does not affect cell viability, but increases the sensitivity of cells in environments with acidic pH or the presence of bile salts, as well as lyophilization, but does not affect long-term survival at -20°C. The treatment with acidic pH and pepsin resulted in a 25% decrease in cell viability in untreated cells and a 50% decrease in cells without S-layer. A second treatment with pancreatin and bile salts resulted in a slight decrease in the number of CFU/ml in the case of untreated cells of and in cell death in the second case. Therefore, these results suggest that surface proteins play an important role in the mechanisms of protection against enzymes and acidic pH in the digestive tract. After removal of the S-layer, the self-aggregating capacity decreased from 20% to 15%, and the degree of hydrophobicity increased from 23.5% to 38.6%. In addition, the removal of surface proteins decreased the affinity of the cell envelop of the Lb. helveticus 34.9 strain to chloroform from 95% to 83%. These results demonstrate the influence of the S-layer on the hydrophobicity and affinity for chloroform of the Lb helveticus 34.9 outer surface.
In the last part of this stage, samples were prepared for the study of the cell coat by scanning microscopy (SEM) and electron transmission microscopy (TEM).
Finally, the results obtained and presented in this report demonstrate that all the objectives set for the second stage of the project have been completed.
[RO] ETAPA II. CARACTERIZAREA BIOCHIMICĂ ȘI BIOLOGICĂ A STRATULUI S
[RO]A doua parte a proiectului a urmărit caracterizarea biochimică și biologică a stratului S sintetizat de Lb. helveticus 34.9. În cadrul acestei etape, a fost caracterizat stratul S prin metode moderne, și anume: electroforeză bi-dimensională, LC-MS și secvențierea capătului N-terminal. Aceste analize au arătat că stratul S are un pH izoelectric de aproximativ 6,9, o masă moleculară de aproximativ 48 kDa și un capăt N-terminal format din arginină și treonină.
În urma experimentelor desfășurate, s-a observat că proteinele de suprafață nu au activitate antibacteriană față de tulpinile patogene Gram pozitive sau negative folosite în acest studiu, însă a fost observată inhibiția creșterii tulpinii Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus LMG 6901T. În plus, s-a observat co-agregarea celulelor de Lb. helveticus 34.9 cu majoritatea bacteriilor testate, patogene sau nepatogene.
Celulele la care s-a eliminat stratul S au capacitatea de a-și resintetiza învelișul proteic exterior, această reformare având loc în primele ore de la reluarea în mediul optim de cultură. În plus, curba de creștere sugerează că celulele tratate cu LiCl 5M tind să prioritizeze reformarea învelișului celular, urmând ca procesul de diviziune celulară să înceapă după restabilirea integrității celulare.
Din analiza profilului electroforetic al proteinelor stratului S s-a observat că acestea sunt prezente pe toată durata creșterii celulare, dar sunt mai abundente în faza de creștere exponențială indicând rolul protector al stratului S în timpul diviziunii celulare. Eliminarea acestui înveliș prin tratament cu LiCl 5M nu afectează viabilitatea celulară, însă crește sensibilitatea celulelor în medii cu pH acid sau în prezența sărurilor biliare, precum și la liofilizare, dar nu afectează supraviețuirea pe termen lung la -20°C. Tratamentul cu pH acid și pepsină a dus la o scădere a viabilității celulare de 25% în cazul celulelor netratate și de 50% în cazul celulelor fără strat S, iar al doilea tratament, cu pancreatină și săruri biliare a condus la o ușoară scădere a numărului de UFC/ml în cazul celulelor netratate și la moartea celulară în cel de-al doilea caz. Așadar, aceste rezultate sugerează că proteinele de suprafață joacă un rol important în mecanismele de protecție împotriva enzimelor și a pH-ului acid din tractul digestiv. După eliminarea stratului S, capacitatea de auto-agregare a scăzut de la 20% la 15%, iar gradul de hidrofobicitate a crescut de la 23,5% la 38,6%. În plus, eliminarea proteinelor de suprafață a dus la scăderea afinității învelișului celular al tulpinii Lb. helveticus 34.9 față de cloroform de la 95% la 83%. Aceste rezultate demonstrează influența stratului S asupra hidrofobicității și afinității pentru cloroform a învelișului celular a Lb. helveticus 34.9.
În ultima parte a acestei etape au fost pregătite probe pentru studierea învelișului celular prin microscopie de baleiaj (SEM) și microscopie cu transmisie de electroni (TEM).
În final, rezultatele obținute și prezentate în acest raport demonstrează că toate obiectivele stabilite pentru a doua etapă a proiectului au fost îndeplinite.
[EN] STAGE III. EVALUATION OF THE BIOTECHNOLOGICAL POTENTIAL OF THE CELLS PRODUCING LAYER S.
[EN] The last activity established within this objective consists in studying the S layer with the use of electron microscopy. Thus, Lb. helveticus 34.9 cells treated or untreated with LiCl 5M to remove the outer protein shell were prepared for scanning electron microscopy (SEM) and electron transmission microscopy (TEM). As observed by TEM, the images confirmed the presence of the outer protein layer at Lb. helveticus 34.9. After the treatment with LiCl 5M, this thin coating covering the peptidoglycan layer could no longer be observed on the surface of the cells.
The biological role of the S-layer for cell protection during passage through the gastrointestinal tract was observed by SEM. Therefor, samples were obtained after each stage of the simulated passage: after treatment with LiCl 5M (or PBS), after simulating the passage through the stomach, and finally after simulating the passage through the small intestine.
First, it was observed that the treatment with LiCl 5M for the extraction of the S-layer did not affect the cell morphology, proving that this method is a gentle and safe one that can be applied for Lb. helveticus 34.9 without affecting the cellular integrity. The second stage of the treatment, the one with low pH and pepsin, imitating the conditions of the passage through the stomach, began to affect the integrity of the cells, those without an S layer being slightly more affected than the untreated ones. Finally, the simulation of the passage through the small intestine produced strong morphological damage to Lb. helveticus 34.9, more devastating effects being observed in the case of cells without layer S. These results can be correlated with the cell viability studied under the same conditions and undoubtedly indicate the protective role of the S-layer for the producing cell, under stressful conditions.
To determine the biotechnological potential of Lb. helveticus 34.9, the HT-29 cell line representing human colo-rectal adenocarcinoma cells with epithelial morphology was selected. To study the adhesion of bacterial cells to the HT-29 cell line, human cells were grown to a confluence of 50-60%. Although the removal of the S-layer has led to a decrease in the adhesion percentage of Lb. helveticus 34.9, the difference between treated and untreated cells is not a substantial one. However, the results indicate that the proteins of the S-layer are involved in the adhesion of this strain to the cell line tested.
The activities carried out in the last phase of the project, together with the results obtained, demonstrate that the last objective has also been achieved.
[RO] ETAPA III. EVALUAREA POTENȚIALULUI BIOTEHNOLOGIC AL CELULELOR PRODUCĂTOARE DE STRAT S.
[RO] Ultima activitate stabilită în cadrul acestui obiectiv constă în studierea stratului S cu ajutorul microscopiei electronice. Astfel, celulele de Lb. helveticus 34.9 tratate sau netratate cu LiCl 5M pentru eliminarea învelișului proteic exterior au fost pregătite pentru microscopie electronică de baleiaj (SEM) și microscopie cu transmisie de electroni (TEM). Cu ajutorul TEM au fost obținute imagini care confirmă prezența stratului proteic exterior la Lb. helveticus 34.9. După tratamentul cu LiCl 5M, la suprafața celulelor nu a mai putut fi observat acest înveliș subțire care acoperă stratul de peptido-glican.
Rolul biologic al stratului S pentru protecția celulară în timpul pasajului prin tractul gastro-intestinal a fost observat prin SEM. Pentru îndeplinirea acestei activități, au fost obținute probe după fiecare etapă a pasajului simulat: după tratamentul cu LiCl 5M (sau PBS), după simularea pasajului prin stomac, iar în final după simularea trecerii prin intestinul subțire.
În primul rând, s-a observat că tratamentul cu LiCl 5M pentru extracția stratului S nu a afectat morfologia celulară, demonstrând că această metodă este una blândă și sigură ce poate fi aplicată pentru Lb. helveticus 34.9 fără a afecta integritatea celulară. A doua etapă a tratamentului, cea cu pepsină la pH scăzut ce imită condițiile pasajului prin stomac, au început să afecteze integritatea celulelor, cele fără strat S fiind ușor mai afectate decât cele netratate. În final, simularea pasajului prin intestinul subțire a produs deteriorări morfologice puternice asupra Lb. helveticus 34.9, efecte mai devastatoare observându-se în cazul celulelor fără strat S. Aceste rezultate pot fi corelate cu viabilitatea celulară studiată în aceleași condiții și indică, indubitabil, rolul de protecție al stratului S pentru celula producătoare, în condiții de stres.
Pentru determinarea potențialului biotehnologc al Lb. helveticus 34.9, a fost selectată linia celulară HT-29 ce reprezintă celule de adenocarcinom colo-rectal uman cu morfologie epitelială. Pentru studierea adeziunii celulelor bacteriene la linia celulară HT-29, celulele umane au fost cultivate până la o confluență de 50-60%. Deși eliminarea stratului S a dus la o scădere a procentului de adeziune a Lb. helveticus 34.9, diferența dintre celulele tratate și cele netratate nu este una semnificativă. Cu toate acestea, rezultatele indică faptul că proteinele stratului S sunt implicate în adeziunea acestei tulpini la linia celulară testată.
Activitățile realizate în ultima etapă de desfășurare a proiectului, împreună cu rezultate obținute demonstrează că și ultimul obiectiv a fost îndeplinit.
[EN] DISSEMINATION OF RESULTS AND LEVEL OF ACHIEVEMENT OF OBJECTIVES
[EN] Some of the results obtained during this stage were presented as a poster at the 13th International Symposium on Lactic Acid Bacteria, which took place online on August 23-25, 2021. (Poster title: Biological role of S-layer produced by Lactobacillus helveticus 34.9).
Also, some results were included in an oral presentation during the national conference The 61st Annual Session of Scientific Communications organized by the Institute of Biology Bucharest on December 10, 2021. (Presentation title: Characterization of the S layer synthesized by Lb. helveticus 34.9).
In 2022, some of the results obtained within this project were presented orally at the 15th International Scientific Conference on Probiotics, Prebiotics, Gut Microbiota and Health - IPC2022, organized between 27 and 30 June 2022, in Bratislava, Slovakia (Title of the presentation: The characterization and biological role of surface-layer proteins produced by Lb. helveticus 34.9).
In addition, an oral presentation will be made at the Microbiology Conference "G. Zarnea" organized by the Microbiology Department of the Institute of Biology of the Romanian Academy, on September 29, 2022 (Title of the presentation: Caracterizarea și rolul biologic al stratului S sintetizat de Lb. helveticus 34.9).
Some of the results were included in an article that is currently under evaluation by the Journal of Applied Microbiology (Impact Factor: 4.06, Relative Influence Score: 1.23). Title of the article: Characterization of S-layer proteins produced by Lactobacillus strains isolated from Romanian artisan fermented products.
The rest of the results obtained within this project are included in an article that is in progress to be prepared to be submitted in a journal belonging to the yellow list.
Finally, the results obtained and presented in this report demonstrate that all the objectives set out in this project have been achieved and the activities carried out have provided valuable results for the national and international scientific communities in the field of food and biotechnology, among others.
[RO] VALORIFICAREA REZULTATELOR ȘI GRADUL DE ÎNDEPLINIRE A OBIECTIVELOR
[RO] O parte dintre rezultatele obținute în cadrul acestei etape au fost prezentate sub forma unui poster la conferința internațională 13th International Symposium on Lactic Acid Bacteria, care s-a desfășurat online în perioada 23-25 august 2021. (Titlul poster: Biological role of S-layer produced by Lactobacillus helveticus 34.9).
De asemenea, unele rezultate au fost incluse într-o prezentare orală în cadrul conferinței naționale A 61-a Sesiune Anuală de Comunicări Ştiinţifice organizată de Institutul de Biologie București în data de 10 decembrie 2021. (Titlu prezentare: Caracterizarea stratului S sintetizat de Lb. helveticus 34.9).
În anul 2022, o parte dintre rezultatele obținute în cadrul acestui proiect au fost prezentate oral la conferința internațională 15th International Scientific Conference on Probiotics, Prebiotics, Gut Microbiota and Health - IPC2022, organizată în perioada 27 – 30 iunie 2022, în Bratislava, Slovacia (titlul prezentării: The characterization and biological role of surface-layer proteins produced by Lb. helveticus 34.9).
În plus, va fi realizată o prezentare orală la Conferința de Microbiologie ”G. Zarnea” organizată de departamentul de Microbiologie al Institutului de Biologie al Academiei Române, pe data de 29 septembrie 2022 (Titlul prezentării: Caracterizarea și rolul biologic al stratului S sintetizat de Lb. helveticus 34.9).
O parte dintre rezultatele obținute au fost incluse într-un articol care, în prezent, este în curs de evaluare la revista Journal of Applied Microbiology (Impact Factor: 4,06, Scor Relativ de Influență: 1,23). Titlu articolului: Characterization of S-layer proteins produced by Lactobacillus strains isolated from Romanian artisan fermented products.
Restul rezultatelor obținute în cadrul acestui proiect sunt incluse într-un articol care este în curs de tehnoredactare și urmează să fie trimis în vederea publicării la o revistă din zona galbenă.
În final, rezultatele obținute și prezentate în acest raport demonstrează că toate obiectivele stabilite în cadrul acestui proiect au fost îndeplinite, iar activitățile realizate au furnizat rezultate valoroase pentru comunitățile științifice naționale și internaționale din domeniul alimentar și biotehnologic, printre altele.
[EN] CONCLUSIONS
[RO] CONCLUZII
[EN] Project conclusions
-Biochemical characterization of S-layer proteins produced by Lb. helveticus 34.9 was performed;
-Lb. helveticus 34.9 can re-establish its outer protein coating in the first hours after resuming in the optimal culture medium. In addition, in the case of this strain, it was observed the prioritization of the reformation of the cell envelope, followed by the beginning of the cell division;
-The S-layer is involved in the self-aggregation of the strain Lb. helveticus 34.9 and its co-aggregation with other bacteria;
-Surface proteins play an important role in the mechanisms of protection against stress, especially against enzymes of the digestive tract and acidic pH, which is observed both by quantifying viable cells and visually with the help of electron microscopy;
-The S-layer influences the hydrophobicity and affinity for chloroform of the cell shell of Lb. helveticus 34.9;
-The adhesion of the strain Lb. helveticus 34.9 to the human cell line suggests its applicative biotechnological potential with the possibility of using the S-layer as a transporter of some molecules.
All the results obtained during the implementation of this project helped to better understand the structure and biological role of the surface proteins synthesized by Lb. helveticus 34.9. One of the most important results relates to the protection that these proteins give to the producing bacterial cells under conditions that simulate the passage through the gastro-intestinal tract. Thus, the cells that present this protein coating on their surface have a higher viability and are less structurally affected, compared to cells without an S-layer. Considering the other properties of the S-layer such as the proven role in bacterial survival at lyophilization, its immediate reformation, the influence on co-aggregation with various pathogenic/non-pathogenic bacteria, as well as the adherence of Lb. helveticus 34.9 to human cells point to the probiotic potential of this strain.
[RO] Concluziile proiectului
- A fost realizată caracterizarea biochimică a proteinelor stratului S produse de Lb. helveticus 34.9;
- Lb. helveticus 34.9 are capacitatea de a-și resintetiza învelișul proteic exterior în primele ore de la reluarea în mediul optim de cultură. În plus, în cazul acestei tulpini s-a observat prioritizarea reformării învelișului celular, urmând ca procesul de diviziune celulară să înceapă după restabilirea integrității celulare;
- Stratul S este implicat în auto-agregarea tulpinii Lb. helveticus 34.9 și co-agregarea acesteia cu alte bacterii;
- Proteinele de suprafață joacă un rol important în mecanismele de protecție la stres, în special împotriva enzimelor tractului digestiv și a pH-ului acid, lucru observat atât prin cuantificarea celulelor viabile, cât și vizual, cu ajutorul microscopiei electronice;
- Stratul S influențează hidrofobicitatea și afinitatea pentru cloroform a învelișului celular a Lb. helveticus 34.9;
- Adeziunea tulpinii Lb. helveticus 34.9 la linia celulară umană sugerează potențialul biotehnologic aplicativ al acesteia cu posibilitatea folosirii stratului S ca transportor al unor molecule.
Toate rezultatele obținute în cursul derulării acestui proiect au ajutat la o mai bună întelegere a structurii și a rolului biologic al proteinelor de suprafață sintetizate de Lb. helveticus 34.9. Unul dintre cele mai importante rezultate se referă la protecția pe care o conferă aceste proteine celulelor bacteriene producătoare în condiții care simulează pasajul prin tractul gastro-intestinal. Astfel, celulele care prezintă la suprafața lor acest înveliș proteic au o viabilitate mai ridicată și sunt mai puțin afectate din punct de vedere structural, comparativ cu celulele fără strat S. Luând în considerare și celelalte proprietăți ale stratului S precum rolul dovedit în supraviețuirea bacteriană la liofilizare, reformarea imediată a acestuia, influența asupra co-agregării cu diferite bacterii patogene/nepatogene, precum și adeziunea Lb. helveticus 34.9 la celulele umane se poate sublinia potențialul probiotic al acestei tulpini.